近日，北京大學彭海琳課題組與合作者發表了題為“Self-assembled superstructure alleviates air-water interface effect in cryo-EM”的研究論文( Nature Commun .2024, 15, 7300)，報道了基于石墨烯-硬脂酸分子自組裝層復合結構(GSAMs)的冷凍電鏡載網，該復合結構在冷凍制樣時顯著抑制了生物蛋白分子因吸附在氣液界面而導致的結構變性和優勢取向問題。同時，GSAMs能顯著豐富蛋白分子在無定形冰中的取向，有利于實現單顆粒冷凍電鏡的高分辨結構解析。通過GSAMs，研究團隊成功實現多種蛋白近原子級分辨率的三維結構解析。

圖1 GSAMs復合膜在冷凍電鏡成像中的優勢：減輕氣液界面吸附與豐富樣品取向

單顆粒冷凍電鏡是目前揭示生物大分子精細結構和反應機理的重要手段之一。在冷凍電鏡成像過程中，生物大分子被封裝在薄層玻璃態冰中，在電子束輻照下，仍處于原始結構和本征狀態。然而對于蛋白質而言，絕大多數蛋白質顆粒在冷凍制樣時均傾向于吸附在空氣-液體的界面處。吸附在氣液界面的樣品容易發生結構變性，并產生單一的優勢取向，嚴重制約蛋白質的高分辨結構解析。為解決這個難題，業內通常引入一層無定形碳膜以避免氣液界面問題，但是無定形碳膜厚度高達3 nm，在電鏡下背景噪音大，并且電子輻照時會產生較大的樣品漂移，顯著降低成像質量。

近年來，北京大學彭海琳課題組致力于開發單原子層厚度的石墨烯功能薄膜及其電鏡載網技術，清華大學王宏偉課題組致力于發展新型冷凍電鏡成像方法及機理研究。雙方強強聯合，基于懸空石墨烯功能膜解決冷凍電鏡成像存在的氣液界面、優勢取向、冰層控制、樣品飄移等問題，以提升冷凍電鏡成像分辨率，取得了一系列研究成果( Adv. Mater. 2017; Structure 2017; J. Am. Chem. Soc. 2019; Nature Commun. 2019; Nature Commun. 2020; Biophysics Reports 2021; ACS Nano 2021; Nature Commun. 2022; Nat. Methods 2023; J. Am. Chem. Soc. 2023)。2024年1月，王宏偉課題組和彭海琳課題組進一步合作開發了一種基于石墨烯“三明治”結構的冷凍電鏡生物樣品制備方法，以“石墨烯三明治技術用以生物冷凍電鏡結構解析”（Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis）為題發表在 PNAS 2024, 121(5), e2309384121期刊上。該研究通過兩層石墨烯對生物樣品溶液進行封裝，制備冰層厚度適宜的石墨烯“三明治”樣品用于高分辨冷凍電鏡重構。生物大分子被封裝在兩層石墨烯薄膜之間，從而徹底避免了氣液界面的影響。并且由于石墨烯優異的機械強度和導電性能，該方法還可以有效抑制冰層形變，降低電鏡成像過程中的顆粒漂移和冷凍樣品在透射電鏡下的電荷積累效應，從而進一步提高冷凍電鏡照片的質量。該工作被Nature Methods作為亮點進行報道(Graphene sandwich for cryo-EM)。

圖2“石墨烯三明治結構”冷凍電鏡樣品制備示意圖(PNAS2024,121, e2309384121)

在最新的研究工作中 (Nature Commun. 2024, 15, 7300)，研究團隊基于硬脂酸分子在石墨烯表面的自組裝行為，獲得液面上自支撐的大面積石墨烯薄膜，即GSAMs，制得的石墨烯電鏡載網能有效抑制冷凍電鏡制樣中的氣液界面效應。該方法簡單易行，且避免了傳統的高分子輔助轉移法帶來的污染。基于此，研究團隊實現了懸空石墨烯電鏡支撐膜的批量制備，其懸空膜完整度高達99.5%。通過掃描隧道顯微鏡(STM)、冷凍電鏡等表征手段，以及DFT理論計算，研究團隊確定了硬脂酸分子的自組裝結構：兩個硬脂酸分子的羧基通過分子間氫鍵連接成環，形成二聚體后實現規則排列。緊接著，研究團隊將GSAMs載網用于冷凍電鏡成像中，發現GSAMs復合膜提供了與蛋白分子相互作用的界面，因此該復合結構對蛋白具有“錨定”作用，在負載時能顯著降低蛋白吸附在氣液界面的比例。同時，研究團隊將GSAMs與冷凍電鏡成像常用的表面活性劑添加劑進行對比，發現GSAMs能更好地提高蛋白分子在冰層中的濃度及取向，有利于高效率、高分辨的三維重構。綜合以上優勢，研究團隊利用GSAMs載網對多種不同尺度的蛋白進行了冷凍電鏡的高分辨結構解析，包括2.6 ?分辨率的鏈霉親和素(streptavidin, 52 kDa)、3.3 ?分辨率的人體血管緊張素轉換酶2-新冠病毒刺突蛋白受體結合結構域復合體(ACE2-RBD, 100 kDa)以及2.0 ?分辨率的20S蛋白酶體(20S proteasome, 690 kDa)等。

圖3GSAMs超結構的制備與表征

圖4 GSAMs復合膜顯著提高冷凍電鏡成像質量，成功解析多種蛋白的高分辨三維結構

該研究工作中( Nature Commun. 2024, 15, 7300)，北京大學彭海琳教授、清華大學生命科學學院王宏偉教授、劉楠博士以及深圳理工大學趙超博士為論文共同通訊作者，北京大學化學學院博雅博士后鄭黎明、清華大學生命科學學院博士生徐潔、中國航天科技創新研究院王偉華博士與北京大學化學學院博士生高嘯寅為論文共同第一作者。北京大學化學學院劉忠范教授團隊、吳凱教授/周雄研究員團隊等為重要合作者。

該工作得到國家自然科學基金、國家重大科學研究計劃、北京分子科學國家研究中心、北京生物結構前沿研究中心、清華-北大生命科學聯合中心、中國博士后科學基金、騰訊基金會等資助，并得到了北京石墨烯研究院、水木未來科技有限公司、北京大學化學與分子工程學院的分子材料與納米加工實驗室（MMNL）儀器平臺的支持。

論文鏈接1：https://www.nature.com/articles/s41467-024-51696-w

論文鏈接2：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2309384121

論文鏈接3：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02219-4

排版：高楊

審核：李玲，高珍