堿基編輯器能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)位點(diǎn)的單堿基編輯，理論上可修復(fù)近60%的人類致病遺傳變異，因此在人類遺傳病的基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景【1】。其基本原理是借助CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行定位，隨后通過融合的堿基脫氨基酶實(shí)現(xiàn)目標(biāo)堿基的精準(zhǔn)突變。根據(jù)脫氨基酶差異，堿基編輯器主要分為胞嘧啶脫氨基酶為核心、可實(shí)現(xiàn)C·G--T·A堿基對(duì)高效轉(zhuǎn)換的胞嘧啶堿基編輯器（CBE），與腺嘌呤脫氨酶為核心、可實(shí)現(xiàn)A·T--G·C堿基對(duì)高效轉(zhuǎn)換的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）【2-3】。考慮到堿基編輯器在基因治療領(lǐng)域的巨大潛力，其安全問題一直備受關(guān)注。其中CBE的安全風(fēng)險(xiǎn)主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)和明顯的RNA脫靶效應(yīng)【4-8】。為降低脫靶效應(yīng)引發(fā)的安全風(fēng)險(xiǎn)，研究者曾嘗試通過多種策略對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)【6-16】。雖然改造后的CBE在DNA和RNA水平的脫靶風(fēng)險(xiǎn)有明顯改善，但是否存在其他未知的安全風(fēng)險(xiǎn)仍有待進(jìn)一步探索。

2023年10月16日，來自復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院的 程田林 實(shí)驗(yàn)室與復(fù)旦大學(xué)類腦智能科學(xué)與技術(shù)研究院 趙興明教授 及 陳靜祺 研究員合作在 Nucleic Acids Research 雜志上發(fā)表了題為 Engineering of cytosine base editors with DNA damage minimization and editing scope diversification 的論文。文章指出，除DNA和RNA水平的脫靶風(fēng)險(xiǎn)外，堿基編輯器CBE還會(huì)導(dǎo)致明顯的DNA雙鏈斷裂風(fēng)險(xiǎn)和基因組毒性。研究者隨后通過蛋白質(zhì)工程改造對(duì)兩種胞嘧啶脫氨基酶進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化，并結(jié)合nCas9內(nèi)部融合策略，對(duì)CBE的基因組毒性以及DNA和RNA脫靶效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化，并有效增加了CBE活性窗口的多樣性。

研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)大鼠APOBEC1來源的經(jīng)典CBE堿基編輯器BE3、BE4和高安全性變體YE1、R33A和R33A-K34A的編輯活性和Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)進(jìn)行分析比較，證實(shí)了YE1的高編輯活性和低Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)。但采用高靈敏性分析工具M(jìn)uTect2對(duì)RNA脫靶效應(yīng)進(jìn)行分析時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)YE1仍有明顯的RNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)（C-U突變數(shù)量是對(duì)照組的2.5倍）。之后研究團(tuán)隊(duì)以應(yīng)用最為廣泛的DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2AX為基礎(chǔ)，通過γH2AX染色和流式分析，對(duì)現(xiàn)有CBEs誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)性評(píng)估，結(jié)果顯示包括高安全工具YE1和R33A在內(nèi)的幾乎所有CBEs都會(huì)顯著誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。最近研究團(tuán)隊(duì)和多個(gè)實(shí)驗(yàn)室指出，通過改造腺嘌呤脫氨酶TadA可構(gòu)建出新型的TadA-CBEs工具，新工具幾乎沒有Cas9非依賴型DNA脫靶和RNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)。不過研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，代表性TadA-CBEs工具TadCBEd和CBET1.46仍能顯著誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。

綜上可知，現(xiàn)有的CBE堿基編輯器幾乎都會(huì)顯著誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，其基因組毒性和遺傳毒性不容忽視，因此需要更進(jìn)一步的優(yōu)化和改造。

除大鼠APOBEC1外，七鰓鰻來源的胞嘧啶脫氨酶（CDAs）和人源APOBEC3A也是構(gòu)建CBEs的常用脫氨酶。研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)不同類型CDAs的編輯活性和Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)N-Lj-BE（脫氨酶為L(zhǎng)jCDA1）具有高編輯活性和低Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)。已知胞嘧啶脫氨酶的RL1和RL2結(jié)構(gòu)域會(huì)調(diào)控其結(jié)合ssDNA的能力并改變序列偏好性，研究團(tuán)隊(duì)用AID/APOBEC蛋白家族的RL1和RL2結(jié)構(gòu)域替換LjCDA1的對(duì)應(yīng)區(qū)域并開展后續(xù)研究。結(jié)果顯示，RL1和RL2替換會(huì)改變編輯窗口、編輯活性以及序列偏好性，這為差異化CBEs的構(gòu)建提供了新思路。之后研究團(tuán)隊(duì)對(duì)LjCDA1來源的CBEs在RNA水平的脫靶效應(yīng)和誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，結(jié)果顯示，LjCDA1來源的CBE幾乎沒有RNA脫靶風(fēng)險(xiǎn)，且多種突變體誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。

隨后研究團(tuán)隊(duì)對(duì)人源APOBEC3A進(jìn)行了系統(tǒng)性的蛋白質(zhì)工程改造和篩選，發(fā)現(xiàn)突變體eA3A-RL1（N57A點(diǎn)突變，RL1區(qū)域替換為APOBEC3G的RL1）構(gòu)建的N- eA3A-RL1-BE具有高編輯活性和低Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)。隨后結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期工作即nCas9的內(nèi)部融合可增強(qiáng)堿基編輯器ABE的編輯活性并拓展活性窗口，研究團(tuán)隊(duì)通過內(nèi)部融合策略構(gòu)建出一系列eA3A-RL1衍生的CBEs工具，并對(duì)其編輯活性、編輯窗口、序列偏好性、Cas9非依賴型DNA脫靶、RNA脫靶以及DNA雙鏈斷裂風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)性評(píng)估。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的內(nèi)部融合位點(diǎn)可以增加eA3A-RL1衍生CBEs工具的窗口多樣性并改變序列偏好性，但均表現(xiàn)出接近本底的Cas9非依賴型DNA脫靶效應(yīng)和RNA脫靶效應(yīng)，且誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。

總體而言，本研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)認(rèn)為的高安全性CBEs會(huì)顯著誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，最終導(dǎo)致安全風(fēng)險(xiǎn)。之后申請(qǐng)人通過蛋白質(zhì)工程改造對(duì)多種代表性胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)，顯著降低了CBEs誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的安全風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)出了高安全性的CBEs新工具，這對(duì)堿基編輯器CBEs的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用有重要的推動(dòng)作用（示意圖）。

示意圖 堿基編輯器 CBE 的安全風(fēng)險(xiǎn)及改進(jìn)

中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）袁博博士，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院張淑倩博士，復(fù)旦大學(xué)類腦智能科學(xué)與技術(shù)研究院宋利婷博士為該研究論文的共同第一作者。復(fù)旦大學(xué)類腦智能科學(xué)與技術(shù)研究院曹際新，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院陳金龍博士、邱佳怡對(duì)本研究亦有重要貢獻(xiàn)。本研究得到了上海交通大學(xué)松江研究院仇子龍教授的大力支持。本研究在國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、“求索”杰出青年計(jì)劃、臨港實(shí)驗(yàn)室、上海市科技重大項(xiàng)目和上海市自然科學(xué)基金的資助下完成。

程田林課題組目前有青年副研究員、特任副研究員和博士后的崗位，歡迎對(duì)基因編輯技術(shù)研發(fā)和腦疾病治療感興趣的科研人員/同學(xué)加入。申請(qǐng)人請(qǐng)將一份詳細(xì)的個(gè)人完整簡(jiǎn)歷（中英文皆可）通過電子郵件發(fā)送至chengtianlin@fudan.edu.cn，郵件標(biāo)題請(qǐng)注明姓名+應(yīng)聘職位。

原文鏈接

https://doi.org/10.1093/nar/gkad855

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